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如何運用生物化學方法檢測細胞凋亡？
發布時間： 2021-12-10 點擊次數： 2365次早期凋亡細胞及活細胞的胞膜正常，DNA染料碘化丙錠(PI)拒染，但可被另外一種DNA染料Hoechst342(Ho342)染色；而壞死細胞的胞膜完整性受到破壞，細胞不需固定即可被PI染色。凋亡細胞的胞膜成分亦發生改變，在凋亡早期，原來位于細胞膜內側的磷脂酰絲氨酸(PS)遷移至脂雙層外側。另外，細胞凋亡時核酸內切酶被激活，首先將DNA切成50～300kb大小的DNA，然后進一步將染色質裂解成單個核小體和寡聚核小體，形成180～200bp的DNA的片斷。而壞死細胞DNA斷裂無規律性。
本期小編帶來細胞凋亡的生物化學檢測方法。
一、Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測方法
原理：在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細胞膜脂質雙層的內側，細胞發生凋亡最早期，膜磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內側翻向外側，這一變化早于細胞皺縮、染色質濃縮、DNA的片斷化和細胞膜的通透性增加等凋亡現象。
AnnexinV是一種磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此AnnexinV被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。
碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但凋亡中晚期的細胞和死細胞由于細胞膜通透性的增加，PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區分開來。
因此，將Annexin V與PI聯合使用時，PI 則被排除在活細胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被FITC 和PI 結合染色呈現雙陽性（Annexin V+/PI+）。這里推薦ZETA LIFE的Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒，實驗操作中效果相當不錯。
檢測方法：1.按照既定程序誘導細胞凋亡；2.按照說明書配制所需溶液；3.常規制備單細胞懸液，用冷PBS洗兩次后，取約5×106個細胞，1500rpm離心，棄上清，將細胞懸浮在400 µl×結合溶液中；4.將細胞懸液分成5管，每管約1×106個細胞，陰性對照管不加任何試劑，陽性對照管加2%多聚甲醛固定30分鐘，用FITC標記Annexin V和PI雙染，余下3管，其中1管只加10 µl PI，1管只加5 µl FITC標記Annexin V，最后一管加10 µl PI和FITC標記Annexin V混合，室溫孵育15分鐘；5.每管各加400 µl 1× 結合緩沖液上機檢測。
注意事項：A.確定細胞凋亡發生的時間，PS外翻只發生在細胞凋亡早期，建議先觀察細胞凋亡的形態后決定取樣檢測時間；B.由于EDTA會絡合Ca2+離子，影響Annexin V與PS的結合，因此建議不用含EDTA的胰酶消化貼壁細胞。細胞經過胰酶消化后可能導致胰酶對細胞的進一步作用從而導致細胞的進一步凋亡，建議在用胰蛋白酶處理前單獨收集培養液中懸浮的細胞，保存在2%的BSA中。
二、磷脂酰絲氨酸單抗（PS）檢測法
原理：與Annexin V相比，PS的抗體可以直接用來檢測細胞凋亡過程中PS的外翻，而且靈敏度高，特異性強，信號持續時間久，費用更低。
三、TUNEL法
原理：TUNEL的全稱是Terminal Deoxynucleotidyl Transferase mediated dUTP Nick-End Labeling，中文名為末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP原位切口末端標記。
細胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個漸進的分階段的過程，染色體DNA首先在內源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30 ﹪的染色體DNA在Ca 2+和Mg2+依賴的核酸內切酶作用下，在核小體單位之間被隨機切斷，形成180～200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現缺口而產生的一系列DNA的3’-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3’-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）。
由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3’-OH形成，很少能夠被染色。低分子量的DNA分離后，也可使用DNA聚合酶進行缺口翻譯（nick translation），使低分子量的DNA標記或染色，然后分析凋亡細胞。
TUNEL或缺口翻譯法實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確的反應細胞凋亡最典型的生物化學和形態特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞凋亡測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，靈敏度遠比一般的組織化學和生物化學測定法要高，因而在細胞凋亡的研究中已被廣泛采用。
不足之處：
(1)壞死細胞亦有DNA裂點形成,也可呈現TUNEL反應陽性，因而特異性較差。據報道，TUNEL反應中壞死細胞的標記量比凋亡細胞的標記量少一個數量級。
(2)TUNEL結合免疫組化檢測時，固定過程對檢測的影響較大，切片的大小、薄厚會直接影響到固定效果，從而產生結果的差異。
四、ISOL檢測法
原理：與TUNEL凋亡檢測法類似，ISOL（In Situ Oligo Ligation，原位寡核苷酸片段連接）也是通過末端標記斷裂DNA的方法。但該方法的創新在于利用ISOL方法，在DNA的片段的平端或3’端單個突出堿基進行連接擴增，鑒于只有發生凋亡的細胞才會發生平端或3’端單個堿基突出，所以ApopTag 過氧化物酶ISOL凋亡檢測試劑盒能夠明確的區分凋亡細胞和壞死細胞。
優勢：原位特異標記，能夠最大限度的降低背景，克服TUNEL法檢測的假陽性，適用于石蠟包埋的組織、冰凍組織、貼壁細胞以及懸浮細胞的凋亡檢測。
五、DNA凝膠電泳(DNAladder)
凋亡過程中DNA裂解是標志細胞最終走向死亡的不可逆的重要過程，DNA凝膠電泳也曾被認為是細胞凋亡判定的金標準之一。抽提細胞的DNA,確定樣品中DNA的量和純度，然后在瓊脂糖凝膠上電泳。正常活細胞的DNA凝膠電泳為一條區帶;細胞凋亡時，由于DNA被裂解成單個核小體和寡聚核小體，電泳時呈現特征性的“階梯狀"(ladder)條帶，壞死細胞的DNA是被隨機破壞的，不能形成階梯狀條帶，電泳時出現類似血涂片的連續性改變。此方法是判斷細胞有無凋亡發生的一種簡便方法，比較適用于體外培養的非增殖性細胞的檢測。
缺點：
(1)特異性較差，特征性的180～200bpDNA梯帶的出現并非凋亡所有，另外在某些罕見的情況下細胞發生凋亡可無DNA斷裂；
(2)不能提供單個細胞或相關細胞的組織學定位或細胞分化等凋亡信息；
(3)不能進行準確定量，只能進行半定量；
(4)靈敏性較差，要求所測標本細胞數在1×106以上才能使電泳清晰；
(5)適用于只含有單一細胞成分標本的測定，對組織細胞組成復雜者，不能確定凋亡發生于哪類細胞。
六、酶聯免疫吸附法（ELISA）核小體測定
ELISA是定量檢測細胞凋亡的免疫化學法，其基本原理是利用夾心ELISA方法檢測細胞凋亡后形成的由組蛋白及DNA的片斷組成的核小體。在微定量板上吸附抗組蛋白抗體，加入細胞裂解后離心所得的含有核小體的上清液，核小體上的組蛋白與包被的抗組蛋白抗體結合；加入辣根過氧化物酶標記的抗DNA抗體，與核小體上的DNA結合；加酶的底物，測光吸收值。此方法敏感性高，所需細胞數少，可檢測低至5×102/mL的凋亡細胞。此外，此方法不需特殊儀器，比較適合基層工作。
缺點：
(1)不能精確測定凋亡發生的絕對量；
(2)適合單一成分細胞的檢測，對于多細胞成分的組織或細胞混合物，不能判定凋亡發生在哪種細胞；
(3)不能提供單個細胞或相關細胞的組織學定位。
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